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实验指导
2012-09-19 23:23  

 

园艺植物育种学实验实习指导

 

编写人员:郭  玲(植物科学学院) 

          吴翠云(植物科学学院) 

          金  强(生命科学学院)

 

 

塔里木大学

二00八年一月

 

 

 

目    录

 

实验一  果树植物种质资源调查.. 1

实验二  园艺植物开花习性的观察.. 3

实验三  自花授粉植物有性杂交技术.. 6

实验四  异花授粉植物有性杂交技术.. 9

实验五  园艺植物花粉生活力测定.. 13

实验六  园艺植物基因组DNA及总RNA提取技术.. 17

实验七  化学诱变染色体加倍及其鉴定.. 22

实验八  果树杂交后代的鉴选.. 24

实验九  聚丙烯酰胺凝胶电泳分析园艺植物同功酶.. 26

实验十  植物抗寒性鉴定.. 31

实验十一  大白菜的产量构成性状的品种间和品种内变异.. 35

实验十二  无性繁殖园艺植物选择育种计划的制定.. 37

实验十三  无性繁殖园艺植物的有性杂交育种计划制定.. 44

实验十四  有性繁殖园艺植物的常规品种育种计划制定.. 46

实验十五  有性繁殖园艺植物的杂种一代育种计划制定.. 50

 

         实验一  果树植物种质资源调查

一、    实验目的  

通过参观果树种质资源圃,学习园艺植物——果树种质资源调查的方法,从现有的资源中发掘优良的地方品种和类型,以及本地特色的野生果树资源,为生产提供有直接经济栽培价值的材料,或为育种及利用做砧木或商品提供有价值的原始材料。加深认识种质资源调查对栽培、育种、和科学研究的重要意义。

二、实验说明

果树种质资源是果树品种选育工作中所采用的原始材料,包括野生类型、半野生类型、栽培类型以及人工创造的育种材料。育种的成就取得很大程度上决定于所收集种质资源的丰富程度,研究是否深入,优良性状是否得到充分利用。种质资源是育种工作的基础,不同的资源有不同的用途。正确地选择和适当地利用当地种质资源对创造新品种具有决定性的意义。因此,提高育种的水平和效能,必须首先进行种质资源的调查、收集、保存,这是育种工作的首要任务之一。果树资源的调查,主要包括地方品种和野生果树。地方品种是在一定地区的栽培品种,它们是在当地自然条件和栽培条件下形成的,没有经过现代育种技术的改进,但它们对当地条件有高度的适应性和抗逆性,适合当地的生产和消费习惯,同时它们有多样的变异类型,是果树选种的重要原始材料。但是,随着品种生产规模化栽培,使得有些具有某些优良性状的果树资源濒临灭绝,因此通过资源调查,挽救保存地方品种是防止种质散失的重要任务。野生果树是在长期进化和自然选择下形成的果树资源,具有高度的适应性和抗逆性,有丰富的抗逆基因,是抗性育种的重要原始资料,有些还可以做砧木,例如:本地的杜梨不仅可以用做砧木还可以将其作为育种的亲本。

目前,果树种质资源保存的方法有下列三种:1、种植保存法;2、离体保存法;3、种子保存法。种植保存法,即种质资源圃,是目前的主要保存方法,可以分级分类建立。种质资源圃的建立要考虑到下列几个因素:要适合于所收集材料的生长发育,生态条件具有一定的地区代表性,栽培经验比较丰富,交通较方便、资源圃的材料分类可采用综合类法或植物学分类法,保存的量以便于保存,研究和节省土地为原则。

三、材料和用具

1.材料:梨、野生杜梨、杏等果树。

2.用具:标本夹、采集箱、剪枝剪、标签纸、调查表、照相机、放大镜、天平、折光仪等。

四、方法和步骤

果树种质资源调查的时间,原则上可以在一年内分期进行,而以萌芽开花期和果实成熟期进行调查最好。调查工作的进程可分为准备阶段和总结阶段。

(一)准备阶段

1.建立调查小组 将参加调查的同学划分为若干调查小组,进行分工协作。

2.拟订调查计划 在调查计划中应包括目的要求、调查内容、地点、方法、途径等项目。果树地方品种与野生果树资源的调查内容不同。野生果树因其是描述在参观中所识别的果树种质资源的主要形态特征、植物学分类和综合分类的类别。

3.进行试点调查 在进行全面调查之前,可选择有代表性的地点和植株进行试点调查,使各调查小组掌握统一标准,熟悉调查的方法。

4.收集相关的资料 广泛收集调查地区的有关参考资料,如:地方志、气象、地理等资料。

5.设计调查记载表格。

(二)调查阶段

1.依靠当地的果农和群众进行走访调查,了解调查树种在当地的生产情况、如:栽培历史、品种、分布范围、面积、适应性、抗性,以及存在的问题等。

2.选定样株 观察植株的物候期、枝、叶、花、果等特性。

3.对调查树种的植株形态、果实进行绘图和拍照。

4.有条件可以做果品的生化分析等工作。

(三)总结阶段

1.整理调查资料  将各类表格和数字资料进行整理统计;将所有调查的图表进行分类、归档。

2.写出调查总结  在调查报告中,首先要明确调查的目的和要求;说明调查树种和品种的情况:果树种类和品种名称、别名、来源、历史、数量、分布范围和面积、品种的植物学性状、生物学特性、适应性和抗逆性、存在的问题等。

五、作

(一)每人根据调查实践,论述果树资源调查的重要性及其与品种选育的关系。

 

实验二  园艺植物开花习性的观察

一、    实验目的

通过观察、了解果树花器结构和开花习性的主要特点及其与坐果的关系,作为制订杂交育种计划、选配杂交亲本和估计杂交进程的依据。从而掌握主要果树花器结构和开花习性的观察项目和记载方法。

二、材料用具

(一)材料  选择当地有代表性的果树树种作为供试株,进行观察。如苹果、梨、桃、葡萄等。

(二)用具  镊子、培养皿、放大镜、纸牌、记载板等。

三、实验说明

不同种类果树花器结构和开花习性差别很大,所以杂交技术也各有不同特点,即使同种果树的不同品种类型也存在一定的差别,如葡萄中有具有完全花品种、雄蕊完全退化的雌能花品种、雄花品种(其中砧木较多)。

果树花期的早晚和长短因种类、品种、以及气候、土壤等条件而异,开花前和开花期间的天气会影响开花的迟早和花期延续时间的长短。本实验应在萌芽前作好准备工作,如选株,制定表格,记载要求等。随着物候期推进和演变,按照物候期观察项目和标准,进行观察记载。

开花期观测取样要注意地点、树龄、生长状况等方面的代表性,一般应选生长健壮的结果树,植株在果园中的位置能代表全园情况。观察株数可根据具体情况确定,一般每品种35株。

四、方法步骤

在确定了观察的品种后,选择具有代表性的植株,进行挂牌标记和编号,同时可以剪取即将开花的枝条插于盛水的瓶中,放置在实验室或温室内进行观察比较,每日定期进行观察。

(一)花器的观察  取大的花蕾,观察花器各部分的结构,注意花药的柱头的位置,以便了解去雄的难易和方法,并绘纵剖图。此外,对单性花类型应分别采集雌花和雄花,并做图。

(二)开花习性的观察

1.观察花在枝条上着生的位置。

2.观察花药开裂情况,散粉时间和花粉量的多少。

3.观察柱头分泌黏液情况和时间。

4.观察花序上不同位置花朵的开放情况。

5.观察记载开花物候期。下面分别介绍几个树种开花习性的观察

苹果和梨开花习性的观察

苹果的花芽为混合芽,一个花序中有花58朵,为伞房花序,花具萼片、花瓣各5枚,花呈白色或淡红色,雄蕊1520枚,雌蕊的花柱分裂为5,基部合一,子房着生于萼筒内,为子房下位花,子房内有心皮5个,每心皮有2个胚珠,受精后内胚珠发育为种子。苹果花期714天,每花序开放过程26天,中心花先开,渐及四周,称为离心开,多数品种中心花坐果率高,(而梨花序开放的顺序为向心开:边花先开,中心花后开,多数品种中心花坐果率高)苹果开花的先后依次为老短果枝群,年青短果枝群,短果枝,中果枝,长果枝,最后是腋花芽。花器的观察 在苹果或梨的盛花初期,观察不同品种初开花朵的形态特征。花冠大小  测量盛开的10朵花的直径,求其平均值。花朵颜色  白、浅粉红、粉红、红。观察不同品种的花芽膨大期(花芽开始膨大、鳞片错开、以全树有25%左右时为准);花芽开绽期(鳞片裂开、露出绿色叶尖);花序露出期 (花芽外层鳞片脱落、中部出现卷曲状莲座叶、花序可观察到);花蕾分离期 (花梗明显伸长,花蕾彼此分离)。开花阶段可以分为始花期(全树5%的花开放);盛花期(全树25%的花开放为盛花始期,50%花开放为盛花期,75%的花开放为盛花末期);落花期 (全树有5%的花正常脱落花瓣为落花始期,95%的花脱落花瓣为落花终期),将观察结果填入表2-1

    2-1 开花物候期记载项目

花芽膨大

花芽开绽

花序露出

花蕾分离

始花期

盛花期

落花期

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

桃花器结构和开花习性的观察

桃树花为完全花,通常有花萼5枚,花瓣5枚,雌蕊1枚,雄蕊多数成三轮着生,花梗很短,花托成杯状,花萼、花瓣及雄蕊着生于花托上,雌蕊与雄蕊的长短依品种而不同,桃的花芽为纯花芽,着生在一年生新梢上,在一株树上开花初期到盛花期大致经过57天, 桃的绝大多数品种是自花能实,因此,在杂交前必须去雄。由于核果类是纯花芽,花芽物候期略有不同。无花芽开绽、花序露出及花蕾分离期,增加露萼期(鳞片裂开,花萼顶端露出)、露瓣期(花萼绽开,花瓣开始露出),其他记载项目和标准与仁果类基本相同。

葡萄花器结构及开花习性的观察

葡萄花芽为混合芽,着生在结果母枝的叶腋,枝条的中下部叶腋芽能形成花芽,但以基部38节形成的花芽最佳,在结果枝上应选择下部的花序供杂交用。新梢下部的花序比上部花序开放早。花蕾一般在上午611时开放,以910时开放最多,一个花序的花期约35天,柱头花蕾开放后46天内有受精能力。大多数葡萄的栽培品种是完全花,花很小,着生在复总状花序上(园锥花序),花冠绿色。上部合生,开花时下部与子房分离,向外卷曲成帽状脱落,雄蕊56个。在栽培品种中,除了完全花品种外,还有“雌能花”品种。这种花的雌蕊完好,有正常受精能力,而它的雄蕊花粉通常是不育的,没有受精能力。

五、作业

1、绘图说明梨或苹果花的开放过程。

2、说明苹果或梨有性杂交最适的枝条和花朵,最适的去雄、采集花粉和受粉的时间。

 

 


 

实验三  自花授粉植物有性杂交技术

自花授粉有两种含义,对于有性繁殖植物,是指雌蕊接受同一花朵的花粉;对于营养繁殖的果树等作物,是指同一品种(基因型)内的相互授粉。在自然条件下,以自花授粉为主的植物就叫自花授粉作物,又叫自交植物。自花授粉作物必然是兼有雄蕊和雌蕊的完全花;而且雄雌基本上同时成熟;不存在自交不亲和等特点;在花器结构上具有某些特点使自花授粉在整个传粉过程中占主导地位,其自然杂交率一般在5%以下。大体上可以分为花粉隔离型和花药包围型。

1.花粉隔离型:有些是整个花冠形成一个隔离空间,使外部花粉不能接触花柱,如小麦、燕麦、冰草等;有些是部分花冠如豌豆、豇豆等豆类蔬菜由两片龙骨瓣合生形成一个隔离空间,不仅使外部花粉难以进入,而且可以使花粉受到保护不易受昆虫吞食和雨水淋湿。

2.花药包围型:指花柱受到裂药雄蕊群的包围,如番茄等由若干枚雄蕊合生的花药筒紧紧地围裹在中间,在授粉受精前难以接触外来花粉。

自花授粉作物群体是由许多遗传组成纯和的个体组成,即使个别植株或个别花朵偶然发生天然杂交,也会因连续几代的自花授粉,而使其后代的遗传组成很快趋于纯和。而且自花授粉作物具有自交不退化或退化缓慢地特点,自花授粉方式是在长期的自然选择作用下产生和保留下来的,具有对物种的生存和繁衍有利的特性。不同科、属的自花授粉植物的有性杂交技术也是不尽相同的,但是,在育种上人工去雄杂交还是一个重要手段。为了提高杂交的结实率,应注意掌握和改进杂交技术,本实验以番茄的杂交技术为例来说明自花授粉作物的有性杂交技术。

一、试材及用具

1.试材:供杂交用的亲本材料为番茄,同时也可根据实验安排,准备葡萄、大豆、芸豆、豇豆等。

2.用具:镊子、授粉器、放大镜、指形管(或小玻璃瓶)、干燥器、培养皿、剪刀、75%酒精棉球、纸袋、纸牌、铅笔等。

二、方法步骤

一)选择亲本并套袋

1.株选:作杂交亲本的种株,无论是父本还是母本,都应具有该品种的典型性,生长健壮,无病虫危害,选好后进行统一编号并套袋,以防昆虫等传递非目的性花粉。

2.蕾选(小麦是穗选):番茄品种多样,有无限生长与有限生长之分,而无限生长型在整枝上多留单杆;有限生长型的则留24杆;这样选择的花序也有所不同:有限生长最好选23穗上的花蕾,每花序选留23个,而无限生长型,则选24穗上的花蕾,每穗留24个花蕾,其余的及已开放的,全部去除。

(二)人工去雄

番茄是雌雄同花,其正常的花药通常联合成一个筒状,其花粉的散裂方式是由花药先端向内纵裂,散出的花粉触及柱头而自交授粉,因此杂交去雄时必须于蕾期进行。去雄时的花蕾应选择:花冠微露、色泽为绿中泛黄。去雄的最佳方法是:先用左手的大拇指和食指夹住花柄基部,然后用右手持镊子伸到花药筒的基部,夹住后轻轻上提,技术熟练时,可一次将花药筒全部取出。葡萄、豆类多为闭花自交,被认为是最严格的自花授粉植物,要选择花冠由绿转淡绿,第二天要开放的花蕾为好)注意一定要把花药去除干净,并且注意不要损伤柱头。操作完成后,挂上纸牌、填好品种名称、株号、去雄日期及操作人等,然后套上纸袋。

(三)花粉采集与贮备

通常于晴天早晨露干后,在选定的父本植物上选取当天盛开的花,用镊子将花药筒取出,放入干燥器内干燥,24h后,将花药取出放在培养皿中,压碎后将花粉过筛装入指形管中备用。一般花粉在干燥、冷凉、黑暗的条件下保存寿命较长。用电动采粉器取粉时,一定要在天气晴朗时进行,以防因花器潮湿不利取粉。如果父本的花期晚,则需要进行催花,即将花枝采回室内插瓶,在温暖的条件下提前开花,然后取其花粉备用。

(四)授粉

通常在去雄的13d内,选择晴朗无风、早晨露干时进行授粉结实率最高。授粉时,动作要轻,用授粉器沾取少量花粉轻擦柱头即可,如果一株上有几个花序留蕾杂交时,可按从下而上的自然位置循序授粉,以防遗漏,为提高结实率,有可能也可重复授粉一次,可由上而下进行。操作完毕,在挂好的标牌上,填好父本名称及授粉次数、具体时间等,然后套好纸袋。在授粉后的810d检查结实情况,并按下表填写有关事项。

注意:所有杂交工作一定注意操作用具的消毒及杀死遗留花粉,即每换一个杂交组合,均要消毒杂粉一次,避免混交。

(五)授粉后的管理

杂交后的最初几天要检查纸袋,如脱落、破碎则可能发生了意外的杂交,这些杂交花就无效了,应重新补做杂交。一周左右,花瓣开始凋谢,幼果渐渐长大时,就可以除去纸袋。以便幼果得到充分发育,同时要防止风、鸟以及病虫的危害。果实达到生理成熟后及时采收,检查结实率。

三、作业思考题

1.交回得到的目的性杂交种子。并将所得结果填于表31,以实习小组为单位汇总结果,并分析成功或失败的经验或教训,提出你的改进意见和建议。

3-1

杂交组合

去雄

日期

去雄

花数

 

授粉

日期

 

授粉

花数

结实数

结实率

备注

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.在自花授粉植物的杂交过程中应该注意的问题有哪些?为什么?

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验四  异花授粉植物有性杂交技术

异花授粉亦有两种含义,对于有性繁殖植物,是指在自然状态条件下雌蕊通过接受其他花朵的花粉受精繁殖后代的植物,对于营养繁殖的果树等作物,是指不同品种(基因型)间的相互授粉,又叫异交植物。异花授粉植物的群体是来源不同、遗传性不同的两性细胞结合而产生异质结合子所繁衍的后代。自花授粉植物和常异花授粉植物限于雌雄同花类型,而且限于被子植物少数几个科、属的草本植物。异花授粉则普遍发生于高等植物所有的科。多数异花授粉作物不耐自交,自交会导致生活力显著衰退。但是雌雄异株和雌雄异花同株类型主要靠其性别分化保证其异花授粉,未发现有特殊的自交不亲和机制。

异花授粉作物在花器结构方面有着复杂的多样性,以多种方式适应异花授粉的需要。如开放传粉雌雄蕊异熟有利于异花授粉;风媒花产生大量小、轻而易于飞扬的花粉,雌蕊具有外露表面大而便于捕捉漂浮花粉的柱头;虫媒花具有对昆虫等传粉动物吸引力很强的色泽艳丽、浓郁而特异的气味、发达的花冠和蜜腺;自交不亲和机制以及上述两个或更多特性的联合机制等。

因不同科属的异花授粉植物具有不同的花器结构,所以应在进行去雄授粉之前必须了解这些不同之处,十字花科蔬菜是目前品种最多,栽培面积最为广泛的蔬菜,并为典型的异花授粉作物,因此本实验以果树中的苹果和蔬菜中的甘蓝为主来说明异花授粉植物的有性杂交技术。

甘蓝开花习性:花序为总状,主茎先抽薹,然后抽出一次枝,一次枝上又抽出二次枝......。花的开花次序是先主茎、后一次侧枝、二次侧枝......,整株的花是由上而下,而每一花序的花则是由下而上开放。早期开放的花会因温度低、授粉不良而结实率低,高次分枝(二次以后的各分枝)顶端的一部分花因营养不良而结实率低,且结的种子也不饱满,这些部位的花蕾均不宜选作杂交用。

通过实验操作,掌握苹果、梨等果树植物、十字花科蔬菜、葫芦科蔬菜、百合科蔬菜、菠菜等异花花授粉作物的有性杂交技术;了解异花授粉植物不同的花器结构和开花动态;根据结果探讨不同杂交组合的结实情况;获得目的性杂交种子以丰富育种的原始材料。

一、 试材及用具

1.试材:供杂交用的亲本材料。可根据实验要求准备试材,如:苹果、梨、大白菜、甘蓝、黄瓜、西瓜、韭菜、大葱、菠菜等。

2.用具:镊子、授粉器、放大镜、指形管(或小玻璃瓶)、干燥器、培养皿、花粉筛、剪刀、75%酒精棉球、纸袋、纸牌、铅笔等。

二、方法步骤

(一)亲本的株选

杂交前必须慎重地选择亲本植株。所选择的植株,树龄最好1015年生,应当发育良好,在栽培上应给予特殊管理使它们在生长期内新梢长度能达5060厘米,叶片健康无病虫害,杂交时最好选用长果枝上的花,其次是中果枝,多复芽而充实的枝条坐果好,着生在树冠中部和上部的花比在树冠内部和下部的花可靠而又坐果好,一般以在长果枝上杂交45朵花能结23个果为原则,中果枝上杂交34朵花,杂交用花最好在枝条上有一定间隔,同一枝上不作杂交的花应该除去。

由于十字花科蔬菜为异花授粉作物,品种内株间的差异较大,所以在选择亲本时一定要选择具有本品种典型性、生长健壮无病虫害的植株,选定后要统一编号,父母本要套袋隔离。

二)花序选择及整枝疏花

一般十字花科蔬菜自然生长的种株分枝较多,而作杂交亲本时,为保证营养和种子的饱满,要适当整理植株,去除过多无效的高次分枝,杂交用花序应选主茎和一次侧枝上的为佳。每序留15个左右的饱满花蕾,去除已经开放或多余的幼小花蕾。

(三)去雄与套袋

除去母体植株花朵中还未成熟花药的操作叫去雄。去雄的目的是为了避免自花授粉和天然授粉,去雄通常在开花前12天,即花苞达最大而花瓣尚未裂开时进行。操作时左手握住去雄花的花梗,右手执着镊子小心的拔开花瓣使雄蕊露出,而后夹去带有花药的花丝;应该避免触破花药和触伤雌蕊。如发现花蕾内有虫或个别花药已裂,说明柱头有可能已接受其它花粉或本身花粉,则应去除不用。如果组合为正反交,可将去雄时取下的花药置指形管中保存,操作时不要损坏柱头,尽量减少破坏花冠。

为避免去雄后的花朵天然杂交,在去雄后应立即套袋隔离,袋内要留有适当空隙,使花朵生长良好,袋自上而下套入,袋口用曲别针或细麻线缝在结果枝上,并挂上纸牌。套袋最好采用“袖筒式”套在整个果枝的中央,袖筒大小为27.5厘米×9.0厘米1张报纸做8个袋,也有单个花朵用一个纸袋的。

为使柱头仍处在一个适宜的环境之中,十字花科蔬菜的去雄时间一般应在6:008:0016:0018:00,因这时温度低,花器失水少,也有利于伤口的愈合。操作完毕后,要套以纸袋,以防昆虫等传粉。

杏、李等果树作物,可采用将部分萼茼、雄蕊及花瓣一次去掉,授粉后套袋,这样显著的提高了杂交效率,在有限的授粉时间内,获得尽可能多的杂交种子。

(四)花粉采集与贮备

去除父本的套袋,选当天盛开的花朵,取回室内,将花药取下,集中于培养皿中,放入干燥器中干燥24h,再取出用花粉筛分离,将筛出的花粉盛入指形管中备用。一般花粉在干燥、冷凉的条件下保存寿命较长。如果父本的花期晚,则需进行催花,对果树植物如苹果、梨等可以将花枝采回室内插瓶(称为切枝水培),在温暖的条件下提前开花,然后按照上述方法取其花粉备用。

(五)授粉

去除母本纸袋去雄12d后的花(即当天盛开的花)用授粉器沾取少量父本花粉轻擦柱头即可,为保证结实率,可重复授粉。授粉的时间可在8:0011:0015:0017:00为佳。少量花序授粉可用授粉器或毛笔蘸花粉授粉;大量花序进行授粉时可将花粉放在透明纸袋内,套到去雄的花序上,用手指从纸袋外面向花粉集中处弹23下,于是花粉便在纸袋中飞扬,约经半分钟,使花粉均匀的落在每朵花的柱头上以后即可取出;也可用小型喷雾器,当手压橡皮球时,将瓶内花粉喷在柱头,授粉操作完毕后,挂上纸牌,注明:父母本名称、株号、去雄日期、授粉日期、授粉次数、授粉(去雄)人等标记,套上纸袋,挂上标签,标明亲本和授粉日期。

(六)授粉后的管理

授粉10天后拆除纸袋,将布条扎在授粉花序上,半月后可进行杂交结实情况的检查。杂交后的最初几天要检查纸袋,如脱落、破碎则可能发生了以外的杂交,这些杂交花就无效了,应重新补做杂交。一周左右,花瓣开始凋谢,幼果渐渐长大时,就可以除去纸袋。以便幼果得到充分发育,同时要防止风、鸟以及 病虫的危害。果实达到生理成熟后及时采收,检查结实率。

注意事项:

1.如果不同的杂交组合是在不同的隔离区内进行,应该分别穿用专用的工作服,以防止人为传粉;

2.杂交工具在每做完一个组合后要用75%酒精棉球消毒,杀死残留花粉。

三、作业思考题

1.交回得到的目的性杂交种子。并将所得结果填于表12,以实验小组为单位汇总结果,并分析成功或失败的经验或教训,提出你的改进意见和建议。

2.异花授粉植物的杂交过程中应该注意的问题有哪些?为什么?

3.简述如何提高杂交结实率?

41

杂交组合

去雄日期

去雄花数

授粉日期

授粉花数

结实数

结实率

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验五  园艺植物花粉生活力测定

在正常条件下花粉在雌蕊上萌发的能力,就是花粉的生活力。在育种工作中,有时需要将花粉保存一段时间。虽然人们已经知道,花粉保存以温度较低(015℃),空气湿度稍干(不能太干)、黑暗条件下为宜。但是各种不同植物花粉寿命长短相差悬殊,这一是由花粉本身的特征决定的,二是由贮藏条件决定的。一般来说,禾谷类作物花粉的寿命较短,自花授粉植物花粉的寿命尤其短,如小麦在花药开裂后30min,花粉即由鲜黄色变为深黄色,此时已有大量花粉丧失活力。在许多特殊条件下,花粉的生活力的测定显的很重要,如:

1.外地采集来的花粉或杂交时父本花期早于母本时都要将花粉进行短暂贮藏;

2.自交或远缘杂交时,为了分析结实率或不结实原因时;

3.为了鉴定雄性不育系时;

4.了解某些杂交技术时,如测定花粉的刺激等作用,测定受精选择性等。

因此,要根据各种植物花粉的特点,采取适当的保存方法。花粉生活力的测定方法很多,其中发芽试验手续较复杂,设备要求较高,需时也较长。为了简易而迅速的测定花粉生活力,也常采用化学染色的方法,但是此法也有缺点,就是染上色的花粉不一定都具有生活力,因为染上色的花粉中也包括了那些生活力弱不能正常发芽的花粉,所以一般常用而且较为可靠的方法仍然是采用花粉发芽实验。要是要求不严格对新采集的花粉还有一个较简便的鉴定方法——形态鉴定法。

本实验目的是学习花粉生活力测定的方法,进而研究花粉寿命长短与环境条件的关系,以探求保存花粉的合适方法。

一、试材及用具

1.材料:几种植物的不同处理花粉;如:梨、黄瓜、杏、苹果植物的花粉。

2.试剂:配制好的缓冲液、联苯胺液、过氧化氢液、TTC粉、蔗糖、琼脂等;

3.用具:显微镜、载玻片、盖玻片、凹面载玻片、玻璃棒、擦镜纸、吸水纸、标签纸、铅笔。

二、方法步骤

(一)花粉贮藏

从发育良好的植株上采下将开的花朵、取出花药放在纸上或培养皿中,放于干燥的室内,令其开裂,花药裂开后将花粉倒入小玻璃瓶或指形管中,口上塞以棉花或橡皮塞,贴上写有品种名称的标签。再把花粉瓶放于干燥器内,使花粉在空气相对湿度较低的条件下(一般040%)保存;为了减少呼吸作用,可以放在低温(04℃)黑暗的地方贮藏。

(二)花粉生活力试验

1、直接检验法

每个实验小组选定同品种种株去雄。注意:选用的花蕾最好是花前12d,且发育正常、饱满。每天去雄20个花蕾,然后套袋隔离,连续5d,共100朵花。这一实验要和花粉贮藏实验相配合,即花粉贮藏的当天开始去雄。授粉时,每去雄一次,分别授以两种不同贮藏条件下的花粉(各10朵),连续5d,就使得贮藏期分别为当天、第二天、第三天、第四天、第五天的花粉授到了去雄后的花蕾上。实验时,一定要挂牌标好品种、花粉贮藏期、贮藏条件、株号、授粉日期、授粉人。等最后一个处理完后十天,检验结实率和结籽率。将得到的结果填入表16

2、花粉发芽法

人为的创造适合于花粉发芽的环境条件,以花粉发芽的情况来鉴定花粉生活力的强弱,此法的缺点是花粉发芽条件与实际不完全相符,所得的结果与实际有一定的差异,但操作方便,能测定出相对发芽率来。

1)培养基的制作与接种

常用的花粉发芽培养基有液体和固体两种。以前者最为简便,本实验选用前者。其有效成分主要有:蔗糖、硼酸、柠檬酸、赤霉素等。不同的植物所用的蔗糖培养液的浓度是不同的。先配制520%的蔗糖或葡萄糖,加12%琼脂,溶于蒸馏水中,加热煮沸即可,再加0.1%硼酸数滴。将已配制好的培养基保持在40温度即不凝固,用玻璃棒点一点培养基敷在载玻片的凹坑内,然后用接种针或解剖针沾以少量花粉。取双凹载玻片,滴2滴培养液于槽中,用解剖针挑少许花粉均匀撒于培养液的表面(注意不必搅拌,以防花粉混于液体中因缺少空气而影响发芽,又因花粉深浅不一而在显微镜检查时因光线折射而不易观察。)将载玻片放在垫有湿润棉花培养皿内或倒扣在培养皿上,并贴上标签写明处理、种类、播种日期,将培养皿放于20的恒温箱中培养。

2)观察记数

在显微镜下,隔一定时间检查一次(花粉发芽快的经过几个小时即可观察到已经发芽,慢的需24小时以上)若发现花粉已发芽时,便按一定方向,就同一视野中用记数器记录花粉粒总数和发芽数,观察记录35个显微镜视野的数字,求其平均数,即得出花粉发芽百分率。花粉发芽的标准,以花粉管伸长超出花粉直径为准。

3.染色法

1)过氧化物酶测定法

原理:具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化物使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色,依据颜色可知花粉有无活力。

a0.2联苯胺溶于100毫升50%的酒精溶液;

b0.15a-萘酚溶于100毫升50%酒精溶液;

c0.25的碳酸钠溶解在100毫升的蒸馏水中。

以上三种溶液分别放入棕色瓶中备用,使用时将这三种溶液等量配成试剂Ⅰ,放入棕色滴瓶中备用,在使用前准备好0.3%的过氧化氢水溶液作为试剂Ⅱ。

使用时,先在载玻片上加少量待测花粉,然后在花粉上滴试剂Ⅰ和试剂Ⅱ各一滴,仔细搅匀,盖上盖玻片,经34分钟后,再放在显微镜下检查,有生活力的花粉呈红色或玫瑰色,无生活力的花粉为黄色或无色,为了确定具有生活力的花粉百分率,要连续观察35个视野,求其平均值,将观察结果填入表内。

2)碘-碘化钾染色法

原理:正常的花粉积累淀粉较多,而不正常的花粉则少。据此,可用化学物质染色,根据呈色反应来间接测定花粉的正常与否和花粉生活力的差别。通常正常花粉用I-KI染色后呈蓝色,而发育不良畸形花粉则不积累淀粉,当I-KI染色时呈黄褐色。

步骤和方法:取花粉撒于载玻片上,加一滴蒸馏水,用镊子使花粉散开,再加一滴I-KI溶液,盖上盖玻片置于显微镜下观察,凡被染色呈蓝色表示具有生活力,呈黄褐色者为发育不良生活力弱的花粉。

3)氯化三苯基四氮唑(TTC)法

原理:凡具有生活力的花粉,在其呼吸作用过程中都有氧化还原反应,而无生活力的花粉则无此反应,因此当TTC渗入有生活力的花粉时,花粉中的脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合,使无色的TTC变成三苯基甲(TTF)而呈红色。

试剂配制:

1.磷酸盐缓冲液  100ml的蒸馏水中,溶解0.832Na2HPO4·2H2O0.273KH2PO4,调整pH值为7.17。Ⅱ.TTC溶液  称取0.020.05TTC, (不同植物所用的量是不同的)溶解在10ml的磷酸盐缓冲液中,放入棕色滴瓶内,置于暗处。TTC为有毒物质,操作时应注意安全。

2.步骤和方法:

1)取少量花粉放在载玻片上,并在花粉上滴上12滴配制液,用玻璃棒混合后盖上盖玻片。

2)将载玻片置于恒温箱中(3540℃)约1520min

3)在显微镜(10×10)下观察:凡具有生活力的花粉呈红色,部分丧失生活力的呈淡红色,无色的是死的和不育的花粉粒。

3.观察和测定结果:每片观察3个视野,统计具有生活力花粉的百分率,填入表中。

4、形态鉴定法

对于新采集的花粉来说,还有一个更为简便的鉴定方法——形态鉴定法。将花粉用解剖针播于一般载玻片上,然后直接放到显微镜下观察,根据形态特征,判断花粉的生活力状况,一般来说,畸形、皱缩、小形化等均为无生活力花粉,而有光泽、饱满、具有本品种花粉典型特征等性状的均为有生活力花粉。将观察的结果统计后填写下表格。

5-1 

种类

处理

时间

发芽前花粉形态

发芽后花粉形态

花粉发芽率(或染色后具有生活力的花粉百分率)

重复I

重复Ⅱ

重复Ⅲ

  

 

 

 

播种

 

检查

 

 

%

%

%

%

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

三、作业思考题

1.测定花粉生活力的意义有哪些?

2.分析在实验中出现的问题,并找出原因所在。

3.将四种方法的结果分别记载于表中,并比较结果是否一致,如不一致,分析其原因。

  实验六  园艺植物基因组DNA及总RNA提取技术

幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段,核较大而胞质较少,核酸浓度高,且内含物少、次生代谢产物少,蛋白质及多糖类物质相对较少,在SDS CTAB物质存在时,经机械研磨,使细胞破裂并释放出内含物,提取的DNARNA的产量高,纯度好。

提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNaseRNase存在于所有的生物中,并且耐沸腾、蒸煮,所以在提取RNA的过程中要防止RNA酶污染,用具如吸头、离心管、水、药品等都要经RNase的抑制剂DEPC处理,即每100mL溶液中加入0.10.2 mL DEPC溶液,37过夜,然后高压灭菌20 min以灭活DEPC。由于RNA容易降解,所有的提取步骤都在冰浴中进行。

DNARNA)定量分析可用紫外光谱分析,原理是DNARNA)分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰,且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外,还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNARNA)带的亮度来分析,因为EB作为一种荧光染料,能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上,在紫外光的激发下产生荧光,DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNARNAMarker作为DNARNA)分子量及浓度的参考,样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNARNA)量的多少。这种方法的优点是简便易行,可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行,缺点是不太准确。

本实验介绍植物DNARNA提取及检测的方法步骤。

一、试材及用具

试材:植物幼嫩组织(如幼叶、花器、幼根)。

仪器、用具:离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。

需配置的药品和缓冲液:

提取DNA缓冲液(CTAB法): 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 mol·L-1 NaCl2% PVP (灭菌后加入2% PVP ,使之充分溶解)。在研磨叶片前加入1%V/Vß-巯基乙醇。

CTAB提取RNA缓冲液为:2% CTAB(W/V)2% PVP(W/V)25 mmol/L EDTA100 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.02.0 mol·L-1 NaCl 0.5 g·L-1 Spermidine(亚精胺)。灭菌后加入2%V/Vß-巯基乙醇。

SSTE buffer为:1.0 mol/L NaCl0.5%SDS10 mmol/LTris-Cl pH 8.01 mmol/L EDTA

TE(pH 8.0):称取1.211 g Tris0.372 g EDTA-Na2 ,先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解,用盐酸调pH 8.0,再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min

氯仿/异戊醇(24:1,v/v):将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀,置棕色瓶中,4保存。

: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀,置棕色瓶中,4保存。

5× RNA电泳缓冲液的配制:依次加入以下成分:10.46 g MOPS 1.7 g乙酸钠,0.93 g EDTA,调pH 7.0,定容到500 mL

RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.00.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油,高压灭菌。

二、方法步骤

一)植物基因组DNA提取

在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20 min,取出后待用,按照下述步骤提取基因组DNA

1)在65°C水浴中预热CTAB提取液。

2)在液氮中研磨23 g新鲜或 -20°C冷冻的样品材料。注意,要研成很细的粉末,动作要快。

3)迅速加入CTAB提取液,混匀,倒入离心管中,65°C水浴30 min。其间不断轻轻摇动离心管。

4)加入5mol/L的乙酸钾充分混匀,在冰浴中放置30 min中,4°C 12000 rpm离心5 min,吸上清。

注意,对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。

5)加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,放置10 min12000 rpm常温离心10 min

6)吸上清到新离心管中,用氯仿/异戊醇重复抽提一次。

7)吸上清到新离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀,-20°C放置1030 min沉淀DNA

810000 rpm常温离心10 min

9)倒掉乙醇,用400 μL70%乙醇洗沉淀,然后用400μL100%乙醇洗沉淀,吹干后用200500 μL TE溶解DNA

10)溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一遍。

11)吸上清到新离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀,-20°


1030 min ,沉淀DNA

12)离心,弃上清液,70%乙醇洗沉淀,再用100%乙醇洗沉淀,吹干后,用200 μLTE 溶解DNA。用紫外分光光度计测定浓度后,按要求的浓度(如200 μg·μL-1)再向DNA溶液中加入适量TE。在 -20°C冰箱中可长期保存。

注意,提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要,不能振荡,不能使用太细口的吸头,也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物,提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、多糖含量高,在提取缓冲液中应提高ß-巯基乙醇的用量,且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚: 氯仿:异戊醇抽提一遍,这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色,若呈褐色则有多酚类物质污染;对多糖含量高的材料,提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高。

琼脂糖电泳检测DNA

制作1%的琼脂糖凝胶,吸取提取的DNA溶液 5 μL,电泳检测,具体方法见实验47。用λDNA做分子量大小的Marker,如果带型不弥散,在与Marker 20 kb的带的相应位置出现整齐明亮的条带,说明基因组DNA完整,没有降解。

(二)植物总RNA提取

165°C水浴中预热15 mL CTAB提取液。

2)液氮中研磨23 g新鲜或-70°C冷冻的材料。

3)转移样品至有CTAB提取液的离心管中,立即激烈涡旋30s,短时放回 65°C水浴中(45 min)。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇并涡旋混合,10000 rpm常温离心15 min

5)将上清转移至一新离心管。重复抽提一次。

6)将上清转移至一新离心管中,加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的终浓度为2 mol·L-1,即加入1/3体积的LiCl4°C下沉淀过夜(最多16h)。

74°C离心1 h(全速),弃上清,用500 μL70%乙醇洗沉淀,然后用500 μL100% 乙醇洗沉淀。

8)用500 μL SSTE 溶解沉淀,转移至1.5 mL离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇抽提一次。

9)加入2×体积的无水乙醇,在-70°C沉淀30 min-20°C沉淀2 h

104°C离心20 min沉淀RNA(全速)。

11)先用400 μL70%乙醇洗沉淀,然后用400 μL100%乙醇洗沉淀,吹干后用65 μLDEPC水溶解RNA

DNase处理提取的RNA

1)用65μLDEPC水溶解RNA沉淀。


2)加入 10×DNase assay buffer 7.5 μL

RNase inhibitor 1.0 μL

DNase 1.5 μL

337°C水浴20min

4)调整样品体积至250 μL(加入175 μLDEPC水)。

5)加入1/10体积3 mol/L NaAc(pH=5.2),25μL,颠倒管子或涡旋混匀。

6)加入2×体积冷的无水乙醇,混匀后,储存在-20°C 30 min

74°C离心20 min,沉淀RNA (全速)

8)用70%乙醇洗沉淀,然后用无水乙醇洗沉淀。

9)吹干后,用50 μLDEPC水溶解RNA。置-70°C冰箱中保存。

电泳检测RNA

1)配制1.2%的琼脂糖凝胶(20mL

称取琼脂糖0.24 g,加DEPC处理的ddH2O 12.04 mL5×RNA 电泳缓冲液4 mL,电炉加热融化琼脂糖,冷却至55°C,加入甲醛1.96 mL,冷却后倒胶。

2RNA电泳

取去离子甲酰胺10 μL,甲醛1.5 μL10× RNA Buffer 2 μLRNA (24 μg, <10 μL) 混合液,65°C加热15min,迅速在冰浴中冷却片刻,然后加入3 μL RNA 加样缓冲液和0.5 μL EB,上样电泳。电泳Buffer 1× RNA buffer

出现的电泳条带有两条,是两条最大的核糖体RNArRNA)分子,即18S 28S rRNA,较小的RNA也很丰富但看不到,因为太小,跑出了凝胶的边界。多数细胞中的信使RNAmRNA)经EB染色后不足以形成可见的带。只要18S 28S rRNA带亮,且28S rRNA大约为18S rRNA 的两倍,说明提取的RNA没有发生降解,纯度好。

RNA提取有其他多种方法,整个流程下来所用时间不同,如专门的试剂盒Trizol可在1.5h内完成RNA的提取工作,但得率较低,适合草本类植物,木本类植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d内完成,但得率高,此法可获大量的RNA用于Northern杂交、基因克隆等工作。

(三)提取的DNARNA)的浓度检测

1)取少量待测DNA(RNA)样品,用TE或蒸馏水稀释50倍(或100倍)。

2)用TE或蒸馏水做空白,在260 nm280 nm310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。

3)加入待测DNA(RNA)样品在三个波长处读取OD值。

4)纯DNA样品的OD260/OD280 大约为1.8,高于1.8可能有RNA污染,低于1.8有蛋白质污染;纯RNA 样品的OD260/OD280 大约为2.0

5)根据OD值计算DNARNA)浓度或纯度。

[SSDNA]=33×(OD 260-OD 310)×稀释倍数

[dSDNA]=50×(OD 260-OD 310)×稀释倍数

[SSRNA]=40×(OD 260-OD 310)×稀释倍数

三、作业思考题

1.提取DNARNA之前为什么要先进行高压灭菌?

2.提取DNARNA的步骤主要有哪些?需要注意哪些问题?

3.如何检测、评价提取的DNARNA的质量?

4.如何确定提取的DNARNA的浓度?


 

实验七  化学诱变染色体加倍及其鉴定

一、实验目的 

学习应用秋水仙碱诱变园艺植物染色体加倍的操作技术,以及掌握染色体倍性鉴定的常用方法。

二、材料和设备 

黄瓜种子以及幼苗;秋水仙碱、二甲基亚矾(DMSO)、聚乙二醇(PEG);蒸馏水,小滴管,50ml量筒,100ml容量瓶,卷尺、放大镜等。

三、说明  

应用化学诱变剂诱导植物产生变异,进行选择育种的方法是化学诱变育种。化学诱变育种分为两类,一类是诱导产生多倍体,常用的试剂是秋水仙碱(Colchicine);另一类是诱发基因突变或染色体断裂,如甲基磺酸乙酯等烷化剂。前者的应用较多、较广泛。

秋水仙碱是从百合科植物秋水仙中提取出来的植物碱,极毒,易溶于冷水和酒精中。用于园艺植物诱变育种的秋水仙碱的有效浓为0.1%1%,以0.2%最有效。秋水仙碱诱变是通过阻断纺锤体的正常形成,使染色体不能分离而导致加倍。由于有效诱变只发生在细胞分裂状态活跃的细胞、组织,所以常用萌动或萌发的种子、幼苗或生长旺盛的茎尖作为诱变材料。二甲基亚矾(DMSO)具有改善细胞膜的透性,可以促进植物对秋水仙的吸收;聚乙二醇(PEG)可以提高细胞的渗透压,利于细胞吸收秋水仙,因此,它们常被用作秋水仙诱变的增效剂。

四、方法及步骤

1、药剂配制

可以先用少量酒精溶解秋水仙粉剂,然后定容到所需的浓度;或直接用冷的蒸馏水配制。实验设计的浓度为0.2%0.5%。秋水仙羊毛酯剂,不同浓度的秋水仙水溶液34,羊毛酯6,充分搅匀,到看不见游离的水溶液为止。

2、诱变

①滴苗:在两片真叶刚吐出(两叶一心)时,分别用0.2%的秋水仙、0.2%秋水仙+1.5%DMSO0.5%秋水仙、0.5%秋水仙+1.5%DMSO每天8001800滴生长点。为了减少秋水仙滴落和蒸发,可用脱脂棉置于生长点上,并在滴后遮盖遮阳网。连续处理5天。20天后,统计成活株和变异株。每种处理至少50株。

②浸种:用0.2%0.5%0.2%秋水仙+1.5%DMSO0.5%秋水仙+1.5%DMSO的秋水仙碱分别浸渍(用湿纱布包裹种子)已经催芽尚未露白的种子6hr12hr24hr。每种处理至少50株。然后播种在营养钵中。1周后统计出苗株和变异株。

    ③四倍体的鉴定:在变异株中鉴定。本实验以间接鉴定为主,直接鉴定为辅。间接鉴定是与二倍体植株相比,同一基因型的四倍体特征如下:生长缓慢;叶片肥厚、色深,叶片较宽或较大,有皱折;茎较粗壮,节间变短;花冠明显增大,花色较重。在显微镜下观察比较变异株和对照株的气孔数目和大小,以及花粉粒的形态。四倍体植株的气孔,通常数目变少,但气孔变大;出现畸形花粉粒和4个萌发孔的花粉粒。果实结籽率低。直接鉴定是由12位同学利用卷须观察体细胞染色体数目,确证是否是2n=28

五、作业

1)秋水仙处理获得的变异株是否都是四倍体,为什么?

2)影响秋水仙碱加倍染色体效果的因素有哪些?

3)总体比较滴苗处理和浸种处理的诱变效果,并对结果予以解释说明。

7-1  不同诱变效果的比较

     

处理株数

成活株、

成活率%

变异株、

变异率%

加倍株、

加倍率%

   

0.2%colchicine

 

 

 

 

0.2%C+1.5%DMSO

 

 

 

 

0.5%C

 

 

 

 

0.5%C+1.5%D

 

 

 

 

总计

-

 

 

 

     

0.2%Colchicine

 

 

 

 

0.2%C+1.5%DMSO

 

 

 

 

0.5%C

 

 

 

 

0.5%C+1.5%D

 

 

 

 

总计

-

 

 

 

 

实验八  果树杂交后代的鉴选

一、实验目的

1、通过对亲本及其杂交后代群体若干性状的特征特性的观察和测定,了解果树有性繁殖后代遗传变异的特点,明确有性杂交选择亲本的原则及其重要性。

2、对杂交亲本和杂交后代若干性状的观察记载,掌握对有关性状的整理分析方法和对性状的遗传变异认识。

3、对亲本和杂交后代果实的外观形态特征和内部质地、风味及营养成分等的评比鉴定,掌握果树品种果实鉴定的标准和方法。

二、实验原理

有性杂交育种就是利用是来源不同、遗传性不同的两性细胞结合而产生异质结合子所繁衍的后代。由于亲本的遗传基础复杂,很多经济性状大多是多基因控制的数量性状,其后代个体的基因组成各不同,因此表现出个体间的不一致性,杂交后代的性状差异很大。对其群体进行鉴定和选择是培育新品种必不可少的途径,且显得尤为重要。

三、材料和用具

1材料  杂交梨后代的果实  亲本的果实

2用具 卡尺,托盘天平,手持测糖仪,水果刀,药棉,蒸馏水,铅笔

四、方法

4.1 拟订评分标准

4.2 样品准备  每样品不少于20个果,品种需编号排列,参加鉴评。

4.3 根据评分标准和记载项目按次序进行鉴评。

4.4 将初评结果进行复评,并计算总评结果。

4 鉴评说明  果实品质鉴评,参考全国优质果品鉴评会制订的标准。

1.苹果、梨鉴评说明

1)果形  指果实形状,主要看其是否具有本品种固有的外观形状;

2)色泽  指果实着色程度,是否达到本品种最佳着色程度,色泽是否鲜艳悦目,果实表面是否光洁等;

3)整齐度  指果实个体之间的形状、大小、着色程度是否一致;

4)肉质  指果肉的松脆程度、致密、沙面、松软、硬韧、粗细等;

5)果汁  指果汁的多少;

6)风味  包括酸甜度、香味和苦、涩味等;

7)果心  指果心大小;

8)总分为100分,其中果形15分,色泽15分,整齐度10分,肉质20分,果汁10分,风味25分,果心5分;

9)评语要求用简炼的文字描述该品种样品的突出特点,梨的评语中要对石细胞多少、果心大小加以说明。

注意事项:

1、根据树种和品种及杂种群体所研究的性状表现,确定适宜的调查项目,其中应有数量性状和质量性状。

2、确定调查标准和样本容量。亲本和杂交后代应用同一调查标准,并在性状充分显示时进行调查,亲本为无性繁殖品种,遗传基础一致,个体差异小,可根据性状表现调查5株,杂交后代因性状分离广泛,应调查全部实生单株,以了解群体内个体间的性状变异幅度,提高研究效果的代表性和可靠性。

3、通过对性状调查所得的数据资料进行统计分析,如适合性检验、显著性检验、方差分析和聚类分析等。

五、实验结果分析

1、将鉴评结果填入下表,并用文字描述各品种的特点。

 

8-1  苹果、梨果实品质鉴评表

样品

编号

  

   

总分

(100)

评语

果形

(15)

色泽

(15)

整齐度

(10)

肉质

(20)

果汁

(10)

风味

(25)

果心

(5)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2、将实验数据进行统计分析后,得出一个初步的结论。

 

 


 

实验九  聚丙烯酰胺凝胶电泳分析园艺植物同功酶

一、实验目的 

进一步掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的基本原理和操作方法。掌握聚丙烯酰胺凝垂直板电泳法分离同功酶的方法。

二、实验原理  

带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动,叫做电泳。若以V代表球形分子在电场中的移动速度,E代表电场强度,q为带电粒子所带电荷量,粒子半径为r,溶液粘度为η,则:V=Eq/(6πγη) 即为电泳速度与电场强度和颗粒所带电荷量成正比,而与颗粒的大小、溶液的粘度成反比。在一定的pH条件下,每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状,在相同的电场经一定时间的电泳,便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质(包括同工酶)分子组成、结构、大小、形状均有所不同,在溶液中所带的电荷多寡不同,在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色,这样就可以在凝胶上展现出蛋白质或同工酶的谱带。聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,缩写为PAGE)是以聚丙烯酰凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体(Acrylamide简称Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N·N'-methylena Bisacrylamide简称Bis)在催化剂的作用下,聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当AcrBis遇到自由基时,便能聚合。引发自由基产生的方法有两种:化学法和光化学法,亦称为化学聚合或光化学聚合法。化学聚合的引发剂是过硫酸胺(简称AP)。在催化剂NNN'N'-甲基乙二胺 Tetramethylenediamine 简称TEMED)的作用下,由AP形成氧自由基而引发聚合反应,由于反应需要TEMED的游离碱基,所以在低pH下,聚合反应可能延迟甚至被阻止。增加TEMED或过硫酸铵浓度可以增加聚合反应速度,但速度过快影响制板操作,两者浓度过高也影响蛋白质活性。光聚合以核黄素(VB2)作为催化剂(可以不加TEMED),在痕量氧的存在下,光照起动核黄素光解形成自由基,从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加。若在光聚合时加入TEMED可以加速聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大,而且随时间延长逐渐变小,不太稳定,所以用它来制备大孔径凝胶较合适。采用过硫酸铵-TEMED化学聚合形成的凝胶孔径较小,而且重复性好,常用来制备分离胶。氧抑制聚合反应,因此凝胶混合物在聚合前需要脱气。AcrBis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度,用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度,用C%表示。

          T%=a+b/m   ×100 C%=b/a+b×100      

式中  aAcr的质量(g);bBis的质量(g);m—凝胶溶液总体积(ml)。在此,abW/W)是关键ab 10时,形成的凝胶脆、硬、呈乳白色ab100时,即使5%的凝胶也呈糊状,易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶,ab要控制在30左右。通常T = 2%~5%时,ab =20左右T = 5%~10%ab =40左右;T = 15%~20%时,ab =125~200左右。T3%~25%的范围内,凝胶易发生聚合。T=7.5%的胶称作标准凝胶。大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。

聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质分离的效应有三个,一是电荷效应:各种蛋白质分子所带电荷不同,在同一电场中泳动率不同;二是分子筛效应;蛋白质分子大小和形状各不相同,在通过一定浓度(一定孔径)凝胶时受阻力各不相同,泳动率也不相同;三是凝胶为不连续系统(凝胶层、pH、电位梯度均不连续),从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带,即所谓浓缩效应,提高了条带分辩率。

同工酶是指能催化同一种化学反应,但其分子结构不同的一组酶。植物同工酶与植物的生长、发育阶段和环境条件密切相关。不同的植物组织或器官由于其形态特征和化学组成各异,合成的蛋白质种类(包括酶蛋白)不同。近期研究表明,植物在非正常生长环境或在其它逆境条件下,可以诱导植物合成新的特异性蛋白,同工酶谱也会发生改变。因此,在研究植物基因表达调控与生长发育及环境条件的关系以及许多生理遗传问题时,常常要分析可溶性蛋白质和同工酶,这在理论和实践中都具有十分重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可溶性蛋白质和同工酶方法简便,灵敏度高,重现性强,结果便于观察、记录和保存,为许多研究者广为采用。

三、实验仪器

移液器、真空泵、真空干燥器、电泳仪、垂直板电泳槽 、电泳玻璃板 、脱色摇床、弯头注射器、微量注射器 、长针头注射器 、烧杯、高速冰冻离心机、白瓷盘。

四、实验材料与试剂

1)实验材料和样品的制备:采摘果树成熟叶片。将干净的材料0.5放入冷却的研钵中,加入样品提取液(0.1M Tris~HCl缓冲液,pH8.0,其中含有0.5M蔗糖,0.006M Vc0.006M Gly0.002M EDTA)冰浴下均浆,14000rpm离心10分钟,保存于04

2)试剂的配制:

A储备液: pH8.9 Tris~HCl缓冲液:1M HCl 48ml36.6g Tris,加蒸馏水到80ml,调节pH8.9定容到100ml

B储备液pH6.7 Tris~HCl缓冲液:1 M HCl 48ml5.98g Tris,加蒸馏水80ml,调节pH6.7定容到100ml

C储备液:分离胶储备液(30% Acr/Bis):30g Acr0.8g Bis,用蒸馏水定容到100ml,过滤备用,4存放可以保存1个月。

D储备液:浓缩胶储备液:10g Acr2.5g Bis用蒸馏水定容到100ml,过滤备用,4可以保存1个月。

E储备液:10% ApW/V):1g定容到10ml-20保存。

F储备液:40%蔗糖:40g蔗糖溶解到60ml蒸馏水中。

3)电泳缓冲液:

6.0g Tris28.8gGly 加蒸馏水到900ml调节pH8.3,定容到1000ml,使用时稀释10倍。

41.5%琼脂 :取1.5g琼脂加入100ml蒸馏水,在电炉上加热融化备用。

50.5M pH7.5  PBS(染色缓冲液)

61M NaOH

71M 乳酸溶液:取85%乳酸2ml,用1M NaOH调到pH 7.0,定容到100ml

80.01%溴酚蓝20%蔗糖溶液

9)基本染色液:称取NBT30mg50mgNAD+ 2mgPMS15ml 0.5M pH7.5 PBS1M 乳酸钠溶液10ml5ml 0.1M NaCl,定容到100ml

100.01M pH6.5  PBS(组织匀浆用)

112% HAC

五、操作

1夹心式垂直电泳槽的安装:

1)将电泳用的玻板,洗净烘干备用。

2)将长短玻璃板分别插在凹形橡胶框中,安装成凝胶模具。切勿用手接触两玻璃板相对的内面。

3)将安装好的凝胶模具安放在储液槽之间,注意短玻璃板面对负极,插上固定螺丝将储液槽和凝胶模具固定好,固定螺丝在拧紧时应双手以对角线的方式旋紧螺丝。

4待电泳槽安装好后,用胶头滴管沿长玻璃板外侧面将琼脂灌入,将长玻璃板下部与胶框的缝隙密封,注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后,模具不应再挪动,以防产生裂缝在灌胶时发生泄漏。备用。

2分离胶的制备:

将需要的凝胶储备液从冰箱中取出,放至室温备用。取一小烧杯,按表1的比例混合,之后将烧杯放在真空干燥器中进行抽气处理,待胶液中没有气泡产生时取出,加入10μl TEMED混匀后使用。

取一定量胶液小心加入到玻璃板之间,在加的过程中注意不要混进空气,当加到液面距离短玻璃板上沿3cm时停止(DYCZ-28B 电泳槽,1mm厚分离胶用量约23ml)。用过的注射器和针头要及时用水清洗,防止堵塞。

另取一带弯头的注射器在其上面小心覆盖0.5cm高的水层,勿使加入的水与胶液混合。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会消失,等再次出现时标志分离胶聚合已经开始,聚合30~60分钟后用滤纸小心吸去表面的水层,切勿破坏胶面的完整性。

3浓缩胶 (大孔胶)的制备

另取小烧杯,按表2的比例混合,抽气,抽气后加入10μl TEMED混匀后使用。用注射器吸取胶液,先用少量浓缩胶液漂洗一下分离胶的胶面,用吸水纸除去,再加入约2.0cm左右高度的浓缩胶液,然后插入样品梳,注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成,再放置30-60min后可以使用。小心拔除样品梳后,用电泳缓冲液漂洗浓缩胶面,再用电泳缓冲液注满备用。

9-1  2.5%浓缩胶配方表

储备液

B储备液

D储备液

E储备液

F储备液

蒸馏水

总体积

用量(ml

1.25

2.5

50μl

5

1.2

10

4待分离样品的制备:

B储备液20μl,蒸馏水60μl20%蔗糖80μl,样品10μl,溴酚蓝5μl混匀备用。

5加样:

分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液,下槽的液面应没过电极丝;上槽的液面应没过短玻璃板上沿0.5 ~1cm。用微量注射器吸取50μl的样品,小心的加入浓缩胶的凹槽内,注意不要让样品溢出槽口。

6电泳

将电泳仪和电泳槽连接,短板与负极相通,长板与正极相通,开通电源。开始时电流为10mA,待样品(溴酚蓝)进入分离胶后,电压可调节电流为20~25mA,当溴酚蓝到凝胶下端附近时电泳结束。电泳过程中要用流水冷却。

    7剥胶

电泳结束后,旋松螺丝取下凝胶模具去掉外面的胶框,用小铲子从浓缩胶一端插入,轻轻将玻璃板撬开,去掉一块玻璃板,在胶板的一端切一小口作为标记。将吸水后的长注射器针头缓慢插入胶板和玻璃板之间,一面注入蒸馏水一面缓慢左右移动同时推针前进。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃板分开。将胶板从玻璃板上取下移入染色用的白瓷盘中。

8染色

将取下的胶板用蒸馏水洗净,放入基本染色液中,在37温度下,保温30min便会有蓝紫色的条带出现。

过氧化物同功酶一般染色5-10秒即可用流水冲洗。

9固定洗脱 

将染色完毕的胶板放入2% HAC中固定保存。可以拍照保存,也可以用扫描仪扫描。

注意事项

1)不能漏胶和上下槽不能泄露电泳液。

2)配药要正确,分离和浓缩缓冲液的pH要调准确。

六、作业

1、设计并测定梨的不同品种的叶片的同功酶并比较差异。


 

实验十  植物抗寒性鉴定

我国园艺植物种类繁多,分布区域广,在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害,常常给越冬植物和果木造成严重伤害。冻害由0以下低温造成,冷害由0以上低温引起,冷害对植物的伤害程度,除取决于低温外,还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强弱决定其生长季节,因此蔬菜作物利用抗寒品种,可以将露地栽培提前,提早供应市场;而选育抗寒性强的果树品种,不仅是寒带果树育种者的主攻方向,而且也是温带甚至热带果树育种者重要育种目标之一。

本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤。

一、试材及用具

1.试材  梨、苹果果树的各种品种树

2.用具和仪器  电导仪,低温冰箱,具塞刻度试管(20ml),恒温水浴锅,温度计,玻璃棒,天平,研钵,石英砂,容量瓶(250ml25ml)。

二、内容说明

植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法。

田间鉴定

田间自然鉴定就是在冻害发生期(早春及晚秋)对受冻的田间植株一定器官、组织以一定的标准进行评价、比较,然后根据冻害情况评价抗寒性。

陈学森等(2001)对山东省春季倒春寒发生后,受害的核果类果树的花器官的抗寒性进行了调查,选出了当地花期抗寒性较强的红荷包、红丰等杏品种,证明种间的抗寒力大小顺序是:桃﹥杏﹥李﹥大樱桃。

赵玉田(1993)对不同生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定,测定的项目包括3个抗冷指标:

相对出苗率(%)(RER):

RER=第一期出苗率/第二期出苗率×100%

出苗指数(EI):

EI=Σ(某日出苗数×播后天数)/ (出苗总数30d )

幼苗干物重(SDW),取地上部三叶期10株幼苗,烘至恒重。

三个抗冷特性以总指数值(TIV)表示,即占各自等级顺序之和。其值反应了低温下种子出苗生长和干物质积累能力。

田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异。该法直接、简单,可进行大范围、大群体的评价,但受地域、品种数量的限制,只能比较少数几个同一地段的品种之间的抗寒力差异,不能对他们的抗寒能力进行量化。

2)受害等级的计算:计算公式:

式中:12345代表不同受害等级;X代表不同受害等级的植株;代表观察总株数。

然后按下表查对耐寒指标及其等级。

10-1  抗寒指标等级表

指标

1.001.50

1.512.50

2.513.50

3.514.50

4.515.00

等级

 

10-2  不同寒害形相及等级

受害等级

寒(旱)害形相

1

顶稍挺拨或有轻度萎焉,能恢复正常生长,无寒(旱)害或基本无寒(旱)害。

2

主干顶部枯萎。

3

主干冻(干)枯约1/3

4

主干冻(干)枯1/31/2左右。

5

不能萌芽(发),全株冻害(干旱)死亡。

实验室间接鉴定

实验室间接鉴定,就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间接推断供试材料的抗寒性。

1、物理指标

Lyons和Raison(1970)证明植物低温发生时,生物膜首先发生膜脂的物相变化,膜的外形和厚度发生变化,膜上产生龟裂,因而膜的透性增大,电解质大量外渗。抗寒性强的品种细胞膜透性增大程度轻,抗寒性差的品种与之相反。因此,测量电解质外渗量变化可以比较植物的抗寒性。在黑穗醋栗、梨、猕猴桃(Shaoli Lu,1990)等许多种果树的不同器官,如花、枝、叶等都有相似结论。另外,通过电导率值配以Logistic方程,可以求出半致死温度,确定植物的临界致死温度。


鉴定抗寒性时,以DTA法测定,一般植物在零下几度即散热结冰,称为高温散热。经过低温锻炼的抗寒木本植物,在连续降温过程中,可见到有多次散热,第一次在零下几度,主要是细胞外结冰,最后一次散热可达-20~-45℃的低温以下,叫低温散热。在低温散热前一霎那的温度,即深过冷温度,用LTE温度表示。深过冷低温散热时,可出现细胞内结冰而使组织死亡。日本京都大学S.K.Kang(1998)等对苹果、桃、梨、柿子和葡萄5种落叶果树通过温度分析测定了两种散热HTE和LTE,发现柿子与葡萄仅有LTE,所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致。

2、生理生化指标

主要包括超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性测定及同工酶分析、丙二醛(MDA)及可溶性糖含量等方法。

在此主要介绍用电导法测定电导率判断不同品种的抗寒性。近年来的研究表明,在低温伤害尤其冷害中,膜系统常常是最先受到伤害的部位,寒害能使脂膜受损伤,透性加大,细胞内离子(主要是K+离子)外渗量增多,电导率加大。因此可以用电导仪测定溶液的电导率,求算电解质渗出率(或称伤害率)。伤害率愈高则愈不抗寒,反之则愈抗寒。

三、方法步骤

1、清洗用具 由于电导率变化极为灵敏,稍有杂质就会造成较大误差,所用的玻璃用具预先用去污粉洗净,再经过自来水反复冲洗,然后还需用去离子水淋洗五遍,最后将玻璃器皿烘干备用。

2、材料准备

(1)冬季或早春选取一年生枝条,每个品种选20枝,采集枝条时,可以选择树冠外围、生长发育较一致的枝条。

(2)用清水洗净枝条,再用蒸馏水冲洗两遍,然后用去离子水冲洗,再用清洁纱布擦干,将材料分成3—5组,分别置于(-10-15-20)不同的温度条件下处理12小时,另设对照不做冷冻处理。

(3)将低温冷冻处理后的枝条剪成2mm的小段,然后称取3克式样投入三角瓶中,并加入30—50ml的去离子水,浸泡24小时后,即可以测定出浸出液的电导率值。测试材料需设重复三次,然后将低温处理后测定过的各样品,放在水浴锅中煮沸1小时,杀死组织,再加去离子水补充到原来溶液的定量,静止冷却后测定其电导度,用百分比法计算供试样品的抗寒力。

3、测量电导度(应用电导率仪)

4、实验结果的计算(用百分比计算法)

电解质(伤害度%)=(处理电导率值-对照电导率值)/(处理煮沸后电导率值-对照煮沸后电导率值)×100%

根据各样品的电解质(伤害度%)百分率大小,就可以鉴定出测试材料的抗寒性强弱。

5、注意事项

1)每测定一个样品,必须用蒸馏水或去离子水冲洗电极,擦干然后再测定另一个样品。

2CO2在水中的溶解度较高,在测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入试管,以免影响结果的稳定性。

3)温度对溶液电导影响很大,必须在相同温度下测定。

四、作业思考题

1.鉴定植物抗寒性的方法有哪些?各有何优缺点?

2.计算各试材的电解质%,列出各个材料抗寒力大小的顺序。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验十一  大白菜的产量构成性状的品种间和品种内变异

一、实验目的

练习研究品种资源的方法,掌握鉴定品种特性的基本技能.

二、实验材料和用具

若干个带根大白菜品种、钢卷尺  砍菜刀  台秤  粗天平 

三、实验观察内容

带根株重  去根株重  株高  株幅  外叶数  球重  球高  球茎  球叶数(长1cm以下者不计)  最大外叶重(精确到克)  最大球叶种  短缩茎重  最大外叶帮重  最大球叶帮重  最大外叶叶身重  最大球叶叶身重

四. 作业

4.1 填写下表

表11-1  品种内株高、株辐、株重的变异

株号

株高(cm)

株辐(cm)

全株重(g)

1

 

 

 

2

 

 

 

3

 

 

 

平均

 

 

 

全株重标准差=

全株重变异系数=

 

表11-2  株重构成性状的品种平均数

株号

1

2

3

全株重

 

 

 

去根重

 

 

 

根重率

 

 

 

球重

 

 

 

球重率

 

 

 

球高

 

 

 

球茎

 

 

 

最大外叶重

 

 

 

最大外叶帮重

 

 

 

最大外叶身重

 

 

 

最大球叶重

 

 

 

最大球叶帮重

 

 

 

最大球叶身重

 

 

 

外叶数

 

 

 

外叶平均单叶重

 

 

 

球叶重

 

 

 

球叶平均单叶重

 

 

 

短缩茎重

 

 

 

 

4.2 分析单株间产量构成性状的变异情况,评价各单株育种性状的优劣。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验十二  无性繁殖园艺植物选择育种计划的制定

一、实验目的

1、了解无性繁殖园艺植物遗传变异的特点及其变异表现,掌握选择育种时亲本的选择原则。

2、了解无性繁殖园艺植物选择育种的种类和特点,掌握单株或混合选择法。

二、实验原理

选择育种就是利用现有种类、品种的自然变异群体,通过选择的手段而育成新品种的途径;选择的本质就是差别繁殖。在无性繁殖的园艺植物中,由于实生繁殖产生的后代,亲本的遗传基础复杂,以及天然杂交,因此其后代表现出个体间的很大差异,或者由于植物体细胞发生突变,通过长期逐代积累或人工选择,造成品种内株、系间在一系列性状上发生显著变异,这就为选种提供了较多的变异来源。因此,可通过单株选择选出优良单株或枝条,再通过嫁接繁殖,用以建立无性系品种,或者通过混合选择,提高遗传增益,改进群体品种的种性水平。

三、材料及用具

1、材料

杏、核桃、巴旦杏、石榴、阿月浑子的实生繁殖果园,苹果、葡萄、无花果等果树集中栽培的成年果园。

2、用具

卡尺、钢卷刀、天平、折光仪、照相机、水果刀、枝剪、油漆、标签、采果袋、记载表等。

四、实验内容

无性繁殖植物的选择育种,包括芽变选种、实生选种。在本实验中,选用无性繁殖园艺植物,针对其存在的缺点或生产上的具体要求,依据每种选种技术的特点,选取其中的一种技术,制定出相应的选种计划,以选出符合生产需求的品种或品系。

五、方法与步骤

1、明确选种对象和目标

选择育种是园艺植物中重要的育种途径。选种对象的选择应考虑对象的起源及市场对新品种的需求状况,充分发挥资源、地域及其他方面的优势,并要掌握国内外有关园艺植物的市场信息及育种动向。目前,有多种园艺植物,如梨、苹果、杏石榴、核桃、巴旦杏等,采用选择途径已选出许多优良品种或品系。

无性繁殖园艺植物的选种目标,与选种对象有关。对于实生繁殖果树作为选种对象的,选种目标一般比较简单粗放,常针对一些主要的经济性状作为选种目标。以板栗为例,如树体的生长势和抗性方面,要求植株生长健壮,具有对当地不良条件的抵抗性;在产量方面要求具有丰产性和稳产性,盛果期产量指标:山岭薄地产量不低于15kg/株,每m2投影面积的产量不低于0.25kg,土层较厚的山坡地,相应为25kg/株和0.5kg,土层厚而肥沃的平地,相应为35kg/株和1.25kg。连续结果3年以上的母枝不低于50%,出籽率不低于40%,总苞内坚果数平均不低于 2.5个,结果枝上的总苞数平均不低于2个。此外,要兼顾干果的外观和食用品质,以及早果性、成熟期等特性。

但是,若对于原有优良品种中进一步选择更优良的变异,或针对其存在的主要缺点通过选择而得到改良,则目标必须明确。以苹果为例,元帅系品种主要应选高桩、浓红型变异,耐贮型变异,紧凑丰产型变异。金冠品种主要应选无果锈的变异,耐贮不皱型变异,紧凑丰产型变异。

2、掌握选种标准

选种目标确定后,要制定各性状的取舍标准。在制定选择标准时应尽可能明确具体,定得适当。如在20世纪70年代,浙江省台州地区在开展少核本地早柑橘的芽变选种中,以果实种子4粒以下作为初选标准。

在进行混合实生选种时主要根据产量来衡量入选树是否符合要求,可以根据标准树的平均产量和标准差,用计划入选率进行衡量,确定出适宜的选种标准。在树体方面要求植株生长健壮,具有对不良条件的抵抗能力,可以按不同程度进行5级评分,将立地条件好坏分为好、较好、一般、较差和差5级,作为评选时决定取舍的参考,对具有特殊性状的单株,如成熟期特早,树冠矮化紧凑,对某种病虫害抗性特强等也应列出,以提供为单株选种材料。

3、选种技术的选择

选择育种的每种选择技术方法,都有其各自的特点,在选种时要灵活运用。要针对每种选种技术的特点,结合选种目标及当地的实际情况,选择出适宜的选种技术。

芽变选种是对自然发生的芽变(体细胞突变)进行选择来获得优良新品系的一种选种方法。其最大特点就是利用果树现存变异,可以在保持原品种综合性状基础上,改进其个体性状,能起到“品种修缮”的作用.果树的芽变现象普遍存在,其表现多种多样,容易被群众发现,因此具有方法简便,见效快,易为广大群众所掌握的特点,是提高改进现有品种的重要捷径,尤其对芽变频率较高的苹果,芽变选种更具有重要的意义。芽变选种的关键在于发现变异,并分析变异的原因,区别芽变和饰变。由于芽变常以嵌合体的形式存在,因此要对变异体进行遗传稳定性测定和筛选变异稳定的材料,并对变异性状进行综合分析研究,以确定其利用价值。

实生选种是对实生繁殖后的变异群体,通过单株选择,从中选出优良的单株,用以建立无性系品种,或通过混合选择,提高遗传增益,改进群体品种的种性水平。由于实生群体常具有变异普遍、变异性状多而且变异幅度大的特点,因此在选育新品种方面具有很大潜力,还由于其变异类型是在当地条件下形成;一般来说它们对当地环境具有较好的适应能力,选出的新类型易于在当地推广,投资少而收效快。

营养系微突变与芽变一样,变异来源于自然发生的体细胞突变,但其突变发生于控制数量性状的基因,表型效应较小,不易和环境效应鉴别,但确实可以遗传。营养系微突变的突变频率较高,并且一般有害的遗传效应较小。利用营养系微突变选种,不仅能提高原品种的产量和品质,而且还能有效地控制病毒的蔓延。

4、确定选种时期

根据选种目标,抓住最有利的时机进行选种,一般在果实采收期。这个时期最易发现果实经济性状的变异,如果实着色期、成熟期、果实形状、颜色、品质、结果习性和丰产性等;其次可在灾害发生期,如霜冻、旱、涝、病虫害等发生后,可选择抗性强的变异类型。

5、选种程序和方法的选择及制定

在选种技术确定之后,选种的程序也就初步确定。

对于采用实生混合选种的园艺植物,可参考以下程序进行制定:

(1)初选  主要进行以下三项工作:①在果实成熟采收前,开展群众性估产报种,然后各级专业选种小组,到现场进行调查观察,逐株进行编号登记;②果实采收时由选种小组到现场核实,剔除不符合选种要求的单株,对有希望的单株进行测产,并对树势、抗逆性、果实品质以及其他情况填表记载,表格设计可参照表1;③将初选表格记录材料,连同单株果实1~1.5kg,经初评记载后报上级评选小组集中鉴评,确定入选的初选单株。

(2)复选  主要任务是对初选材料集中在相对相似的条件下进行科学的分析鉴定,从中选出符合选种目标要求或具有其他特点的优良品系。复选工作主要是在高接鉴定圃和选种圃中进行,即对初选优株高接鉴定其变异的稳定性、变异的性质和程度以及经济价值等。在进行高接鉴定时要用原品种做对照,经结果鉴定的有希望优株,应尽快嫁接繁殖建立选种圃,以便对芽变系进行系统观察和全面鉴定。到结果后经三年的连续观察,同时参考原母树和高接鉴定树的表现,复选出优异的单系参加决选,并要进行多点试验,以鉴定其风土适应性。

(3)决选  主要任务是对经过复选的优良品系进行最后的评定工作,以决选出最优异的新品系。具体方法是:先由选种组根据复选结果提出决选申请,并向鉴评委员会提供完整的记录资料,以及有关的鉴定和评价。而后由主管部门组织专家进行最后的鉴评,如认为确属优良品系而有发展前途的,即可作为芽变新品系而命名和繁殖推广。

6、组织实施选种

在选种目标、程序和时期确定之后,即可按要求组织实施。在实施过程中,要根据不同阶段的任务,有条不紊地协调进行。为此,应周密地做好实施计划,包括实施人员、时间、地点、方法、经费等。

六、实验结果分析

选种计划制定后,要仔细分析选种目标是否明确、标准是否适当、时期是否合理。另外,还要分析选种技术选择得是否正确,选种程序是否有利于选种过程的正常进行。最后,还要实事求是地对实施过程进行评定,以保证选种的顺利实施。见表 1,表2,表3。

表1  苹果芽变选种记载表

选种地点:                                                                

品种名称:                                                                

植株编号:                                                                

选种地的自然条件:

地形:山地、丘陵、平地、冲积地、河滩                                    

  土壤:土质、厚度、pH、地下水位、结构                                     

  海拔:                                                                 

植被:                                                                

被选择品种的正常表现:

树龄:               繁殖:                      

树形:               枝:                         

叶:               果:                         

被选单株的变异现象:

树形:                枝:                            

叶:                  果:                            

变异的主要器官:                                                          

变异的主要特征:                                                          

变异性质:(遗传性变异或彷徨变异)                                          

变异类型:(劣变、优变)                                                     

当地群众对变异的评价:                                                     

                                                                

选种者的评价和利用意见:                                                   

                                                                

选种人:              选种日期:   

表2  核桃选种单株记载表

选种地点:                                                                

品种或品系名称:                                                          

植株编号:                                                                

选种地的自然条件:

地形:山地、丘陵、平地、冲积地、河滩                                   

土壤:土质、厚度、pH、地下水位、结构                                   

海拔:                                                                

被选植株状况:

树龄: 树势: 树高(m): 冠径(cm)东西南北                

干周(cm):(离地面10cm处的直径) 干高(cm):                   

繁殖方法:砧木名称:                                   

枝梢抽生情况:                叶片特征:                           

栽培管理情况(施肥、修剪、病虫防治及间作情况):                          

病虫危害情况:                                                          

适应性:                                                                

抗逆性(抗寒性、抗旱性以及其他抗逆情况):                                

果实特征:

果形:       单果重(g):     果皮色泽:    整齐度:               

单果纵径(cm):     单果横径(cm):                 

品质:                   风味:                              

果皮厚度:              种(皮)仁颜色:           出仁率(%):        

不饱和脂肪酸含量 (%)                                                     

成熟期:                           早实性:                              

产量:       当年:        去年:       前年:            

变异特点:                                                                

田间总评:                                                          

                                                                              

优点:                                                                    

缺点:                                                                    

记载人:               记载期                          

 

 

 

 

实验十三  无性繁殖园艺植物的有性杂交育种计划制定

一、实验目的

学习无性繁殖园艺植物的有性杂交育种计划的制定方法,初步掌握无性繁殖材料新品种的选育技术,结合本地园艺资源适应性状况,找出需要加以改进的某些性状作为育种选育的目标,设计出切实可行的实验计划,并逐步实施,依次验证所制定育种计划的可行性及正确性。

二、育种计划制定的依据

在园艺植物中有许多种类都是高度杂合的,通常采用无性繁殖方式繁育后代,以保持其优良品质。但是品种的优良特性具有历史性、阶段性,不会有任何品种或品系一直维持高的市场占有率。而且作为一个遗传组成高度杂合的群体,随着时间的推移加之环境条件的影响,某些原有的性状可能不再适应本地的生态条件或其部分商品性状不能满足市场的要求,在这种情况下,就需要进行遗传改良。从另一个角度讲,通过有性杂交可以创造新品种或新类型,丰富种的遗传组成。

杂交育种前,首先要明确所要改进的商品性状,确定育种目标。然后寻找可能的杂交亲本,并对杂交亲本主要性状进行考证,了解性状优缺点和发展潜力,确定杂交组合。杂交亲本的选择是杂交能否成功的关键,要对其进行全面、彻底的分析。亲本的选配原则是:

(1)所选杂交亲本应具有所需的优良性状,且两亲本的优缺点能互补。

(2)两个亲本的来源最好是地理位置相隔较远、生态类型不同,这样的组合可以丰富杂种的遗传性,增强杂种优势,获得分离较大的或者超越双亲的遗传类型。

(3)筛选亲本要考虑遗传传递能力的强弱。尽量选择野生、较老的品种、当地品种、成年品种、自根品种,其遗传传递率相对较高。尤其母本要选用优良性状较多的品种。

(4)选择结实性强的种类作母本,父本的花粉要多,以便获得较多的杂交种子。

此外,还要对杂交亲本的开花习性、授粉受精以及结实情况详细了解。否则,可能导致杂交的失败,如花期不遇、花粉不亲和等。某些园艺植物本身授粉受精率极低或结实率极低,都会严重影响杂交育种进程。在杂交前要正确判断。

虽然绝大多数无性繁殖的园艺植物自花结实率较低,但并非自花不实,所以杂交去雄以及种间隔离工作仍要仔细认真,总之,在进行无性繁殖园艺植物的有性杂交育种时,只有严格按照制定的计划去做,才有可能创造出新的品种和新类型。

三、育种计划制定的内容

根据当地应用的无性繁殖的园艺植物选择几种作为本实验设计的试材,要求所选试材具有典型性、可行性以及有发展潜力。

(一)确定育种目标

育种目标必须从生产或实际出发,有针对性,重点突出。通常每次只制定一个重点目标。如抗旱性或花色等。

(二)技术路线和实施方案

1.查阅资料,观察、筛选杂交亲本 了解亲本品种所有性状的优缺点,并预测亲本杂交性状的遗传动态。对亲本材料的主要性状进行观察记录,尤其是开花结实习性的观察。将结果记录表1。

注:观察的性状指标要根据所选园艺植物确定,尤其是确定的育种目标,如花卉杂交育种中,花色、花期、花径、香味等是观察的主要性状,而产量是次要或被忽略的,而果树杂交育种中,产量则是要观察的主要指标。

2.杂交组合的确定 根据育种目标和亲本习性,选定合适的杂交组合,各组合产生的杂种应有可能产生所期望的性状。 3.确定杂交方式 选定杂交亲本确定杂交组合后,就要选择确定杂交方式。通常采用如下方式: (1)成对杂交:当两亲本性状互补,并可能获得符合要求性状时,多采用这种单杂交的方式。

(2)复合杂交:在两个以上亲本间进行杂交时,一般先配成单交,再根据单交种存在缺点选配另一互补的单交组合或亲本进行杂交。表示方法有(A×B)×C,(A×B)×(C×D),〔(A×B)×C]×D。

(3)回交;回交可以使亲本的某种优良性状得以加强,

(4)多父本混合授粉。

4.确定杂交组合的杂交花朵数 杂交花朵数由授粉结实率、杂交果实的坐果率、杂交果实内种子数、杂交种子的发芽率、希望获得的杂交苗数等指标确定。

5.制定育种圃地的栽植计划

6.制定杂交技术的操作规程 包括母株的选择、杂交花朵的选择、花粉采集贮藏、母本植株花器官的去雄操作和授粉技术、授粉花器官的隔离技术等。

7.杂交授粉的操作时间和位置选择

8.杂交后代的选择

四、实验作业

 1.制定某个具体的无性繁殖园艺植物的有性杂交计划。

2.写出在育种实施过程中应注意的问题。

 

 

 

 

 

实验十四  有性繁殖园艺植物的常规品种育种计划制定

一、实验目的

通过利用已学有性杂交育种知识制定具体育种计划,提高学生解决实际问题和综合应用能力。

二、育种计划制定的依据

有性繁殖园艺植物常规品种育种途径有选种、组合育种、诱变育种等,其中以组合育种为主。组合育种又称常规有性杂交育种,是根据品种选育目标选配亲本,通过人工杂交的手段,把分散在不同亲本上的优良性状组合到杂种之中,对其后代进行培育选择,比较鉴定,获得遗传性相对稳定,有栽培利用价值的定型新品种,由于其重要性状基本上是稳定的,在生产上可以继续繁殖制种。

()亲本的选择选配

组合育种的关键在于亲本的选择选配。首先要根据育种的目标要求选择优良亲本材料,然后再依据目标性状的遗传规律及亲本所具有的特征特性,按照亲本性状互补的原则配组杂交。

()杂交方式的确定

杂交方式要根据育种目标和亲本的特点来确定,一般有以下几种方式。

1.单交  又叫成对杂交。在杂交育种中用的较多。用甲作母本,乙作父本,则甲×乙为正交,反之则为反交。

2.回交  杂交后代再与亲本之一进行杂交称为回交。用做回交的亲本称为回交亲本,多代用于回交的亲本称为轮回亲本。只参加第一次杂交而不参加回交的亲本称为非轮回亲本。

回交对于自花授粉作物效果较好,异花授粉作物由于回交会产生近亲繁殖的拮抗效应而降低结籽率,为此必须增加杂交数量或选用与轮回亲本性状相似的其他品种回交,这种选用性状相似的多个品种作轮回亲本的方法称为改良回交法。

3.复交  即选用两个以上的亲本进行二次以上的杂交称为复交,又称多亲杂交。缺点是规模大、需时长。根据参加杂交的亲本数量有三亲杂交和四亲杂交等;根据亲本参与杂交的次序有添加杂交和合成杂交。

在应用复交时,合理安排各亲本的组合方式以及在各组杂交中的先后次序是非常重要的。

()杂交后代的选择方法

有性繁殖园艺植物如部分花卉和蔬菜的杂种后代,选择方法常采用系谱法、混合法和母系选择法。系谱法是国内外在自花授粉作物和常异花授粉作物杂交育种中最常用的方法,但较费工;混合选择法在异花授粉作物中是简便实用而有效的选择方法,但选择进展和纯化速度较慢;母系选择法不及系谱法,但比混合选择法选择效率高。

()组合育种程序

整个组合育种与有性繁殖作物的选种程序相似,其进程由下列几个内容不同的实验圃组成。

第一步 原始材料和亲本圃 用于选配亲本进行杂交

第二步 杂种圃 用于选择单株或集团

第三步 选择圃 用于选择株系或其混合群体

第四步 品种比较试验圃 用于比较鉴定

第五步 生产试验圃 区域试验圃用于探索栽培方法,确定推广范围

第六步 品种审定和推广

1.原始材料圃和亲本圃  根据育种目标搜集种质资源与建立原始材料圃,在原始材料圃中根据育种目标及选配亲本原则选配亲本,通过有性杂交得到变异类型。

2.杂种圃  种植有性杂交得到的变异类型,并从中选择优良的单株或集团。

3.选种圃  种植由杂种圃选出的优良单株或集团以及它们的后代,并进行比较鉴定和选择,选拔出优良株系或其混合群体。

4.品种比较试验圃  对优良株系或其混合群体进行更为全面的准确的比较,从中选出比对照品种更优良的新品系。

5.生产试验和品种区域试验圃  主要任务是把选出的新品系做生产栽培试验和地区适应性试验,以便确定新品种的推广地区,并做到良种良法相结合,发挥新品种的经济效益。

6.品种推广  将新选出的品种报请有关部门,并给予正式定名,加以推广和应用。

三、育种计划制定的内容

开始育种之前,应该制定一个完整的育种设计方案,这个计划并不是一成不变的,根据不同的物种必要时可稍加调整。以番茄为例介绍有性杂交育种计划设计。

()育种目标

主要应根据番茄生产及市场发展情况来分析,如我国八五攻关项目番茄新品种选育技术研究专题的育种目标为多抗、丰产、优质露地鲜食番茄新品种,具体技术经济指标为:抗TMVCMV,兼抗枯萎病或叶霉病、青枯病,单位产量比六五七五同类主栽品种提高10%以上;畸形果率及裂果率分别低于15%,可溶性固形物含量高于4.5%,糖酸比45,果肉硬度高于3.528×104Pa,风味优于同类主栽品种。

()技术路线和实施方案

1.原始材料的搜集及整理  通过多种途径搜集番茄种质资源,利用仪器测定及感官鉴定,结合统计分析,筛选优质或具特殊性状的原始材料。

2.亲本的选择和选配  正确选择选配杂交亲本是有性杂交育种的首要工作。

亲本选择要根据品种的选育目标,确定对当选亲本的性状要求,要分清主次,对一些重要经济性状,如丰产、优质、熟期等复合性状要分析并明确构成目标性状的单位性状,此外,要掌握育种目标所要求的大量原始材料,了解目标性状的遗传规律,入选的亲本要优良性状多,优良性状的遗传传递力要强,不良性状的遗传传递力要弱。

亲本选配要注意亲本双方优良性状的互补,以及构成同一性状的不同单位性状的互补;以具有较多优良经济性状的亲本为母本,以具有需要改良性状的亲本作父本,会使杂交后代出现综合优良性状的个体往往较多;当目标性状为质量性状时,双亲之一具有即可,即使该目标性状为隐性时,虽然双亲都不表现该性状,但只要有一亲是杂合性的,后代仍有可能分离出所需的隐性性状。此外,要用普通配合力高的亲本配组。普通配合力高,杂交后代出现超亲变异亦多,通过选择有可能成为定型的优良品种。

3.杂交后代的选择  杂交之后进行系谱选择曾经是番茄改良最常用的育种方法,下面将介绍以丰产性为首要目标的系谱选育程序。

番茄产量的遗传力不高,在选择过程中应把针对产量的鉴定选择主要放在以株系为单位F3及其后代的世代,而在F2不宜根据单株产量作严格的淘汰选择。由于自F2开始的系内分离随着每代自交而减轻,所以系谱选择时,选择群体的大小每代要减少50%。随着代数的增加,选择的重点应从早代的单株表现转移到更高世代的系统表现。

(1)杂种第一代(F1):可分别按组合播种,两旁播种母本和父本,每一杂交组合的F1种植一个3050株的小区。根据各组合F1的产量和其他性状表现,淘汰一些不良组合,通常选留310个组合;在中选的组合内只淘汰假杂种和显著不良株,其余植株按组合采收种子。

(2)杂种第二代(F2)F2的群体应大些,每组定植500600株,并适当播种对照品种,在同一圃地同时进行系统间和系统内选择,不同系统内人选株数不等,对 F2的选择标准不要过严,以免丢失优良的基因。要多入选一些比较优良的单株,通常优良组合的入选株数为本组合群体总数5%10%。原则上,下一代每一株系的株数可少些(几十株),而株系数多些。

(3)杂种第三代(F3):将每一个F3单株的后代系统定植一小区,每小区几株,每隔510系统设一对照小区。原则上入选的系统可多些,每一系统内入选株数少些(510),以防优良系统漏选。

(4)杂种第四代(F4):在F4代先从优良系统群中选择优良系统,再从优良系统中选择优良单株,2030F4株系,每小区定植2050株,重复3次,选留48个株系。对一致性已很高的系统,可以采用系内去杂去劣留种,对一致性不够高的系统,可再进行一两代的单株选择。如果在F3F4中未出现超过对照的株系,或未出现性状达到期望水平的植株,则可用亲本之一回交或与另一品种再杂交。

(5)杂种第五代(F5)及其以后世代:F5时,多数系统已稳定,主要进行系统的比较和选择。F5以后,首先选出优良系统群,从优良系统群中选出优系混合留种。

4.品种比较试验和区域性试验 对选出的优良株系或混合群体,进行品比试验和区域性试验,以便确定新品种的推广地区,并做到良种良法相结合。

四、实验作业

选择一种有性繁殖的园艺植物,根据市场和生产需求,结合现有种质资源和品种现状,制定一个常规品种育种计划。



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验十五  有性繁殖园艺植物的杂种一代育种计划制定

一、实验目的

通过利用所学杂种优势育种及相关章节的育种知识,制定具体育种计划,加深对所学知识的理解。

二、育种计划制定的依据

优势育种是先使亲本纯化为自交系,然后使纯化的两个自交系杂交获得杂种一代用于生产。当然,亲本也可为品种,但自交系间的F1优于品种间杂交。杂种优势强弱主要决定于亲本自交系或品种的配合力。因此杂种一代的育种实际上包括两个相互关联的育种步骤:一是自交系选育,有些作物还包括不育系、保持系、自交不亲和系等的选育;二是配合力测定,主要进行自交系或品种的配合力测定,筛选优良杂交组合。考虑到F1种子生产的难易,在杂种一代选育过程中应加强对与亲本繁殖和配制杂种有关性状的选择。

()亲本的选择和选配

要紧紧围绕育种目标来选择选配亲本。要根据目标性状的遗传规律,注意构成重要经济性状的各目标性状之间的互补和积加,尽量使亲本的优良性状能在Fl充分表现出来。亲本的选择选配应从品种开始,然后,在选定亲本品种内选育自交系,这样可以缩小自交系的选育范围,减少以后的工作量。

()自交系的选育

优势育种的关键在于选择优良的自交系。自花授粉作物的品种近似自交系,可直接利用基因型纯合的品种作亲本或从品种中经过少数几代选择获得自交系,异花授粉作物应该首先选择优良品种或杂交种强制自交育成纯度很高的自交系。当选定作为亲本的材料是地方品种时,需要采用系谱法,经过连续46代的自交、分离、选择,获得性状整齐一致遗传性稳定的纯合自交系,然后再进行杂交组合的选配;当选定的亲本材料已经是一个自交系,但在个别性状上表现不良或不够突出时,就需要对其进行改造。一般可以采用轮回选择法、回交法和多亲聚合改进法来改造和提高自交系的质量。为了加速自交系的选育进度,可采用花粉()培养法,培养单倍体植株,然后再使单倍体加倍,获得纯合二倍体。

()自交不亲和系的选育

先对初选配合力高的亲本,进行自交不亲和性的测定,选择标准通常是花期自交亲和指数小于0.51,蕾期自交亲和指数大于5,可用荧光染色快速测定法测定自交不亲和性。初步获得的自交不亲和株系纯度不高,不亲和性不稳定,必须经过多代(一般为45)自交选择。这样选育出来的系统还要测定系内兄妹交的亲和指数,淘汰系内兄妹交亲和指数大于2的系统。常采用以下一些方法:

1.全组混合授粉法  10株的花药等量混合均匀后采粉,授到提供花粉的 10株的柱头上,测定亲和指数,优点是比较省工。缺点是如果发现有结实指数超标的组合时,不易判断哪一个或哪几个父本有问题,不便于基因型分析和淘汰选择。

2.轮配法  每一株既作父本又作母本分别与其他各株交配,包括全部株间组合的正反交和自交。优点是测定结果最可靠,缺点是组合数太多、工作量大。

3.隔离区自然授粉法  10株栽在一隔离区,任其自由授粉;优点是省工省事,并且测验条件与实际制种条件相似。缺点是要同时测验几个株系时需要几个隔离区,而网室和温室隔离往往使结实指数偏低。

()雄性不育系的选育

1.原始不育材料的获得  利用自然变异、人工引变、远缘杂交、自交和品种间杂交、引种等途径获得原始不育材料。

2.核基因雄性不育系选育  下面以一对隐牲核基因控制的雄性不育两用系为例介绍选育方法。

(1)选株:依据核不育的特点,应在花期参照花器不育形态选株。同时将入选株花器进行镜检,选留无花粉或花粉粒变形的不育株。

(2)测交得到不育株:应选择几个父本品种测交,以期获得F1育性分离,比例为半数可育株,半数为不育株。具体做法是用选得的不育株和某些品种测交,同时将测交父本进行自交保存。

(3)测交后代观察:测交一代能育株和不育株比例接近11的组合,应届核质不育类型,择优保存,于下一年进一步将不育株和同系姊妹可育株进行第二次测交,如此继续测交35代,获得能育株和不育株分离的比例为11的稳定株系,即为两用系。

3.质核互作雄性不育系的选育

(1)测交及连续回交筛选保持系以不育株为母本,选用准备作亲本之一的品系内若干可育株作为父本成对杂交,选出F1全为不育株的组合,其母本为不育系,父本为相应的保持系。

随后以保持系自交,同时作为轮回亲本和不育系进行饱和回交,直到不育系和保持系性状一致为止。

(2)人工合成保持系比较麻烦,只有通过其他途径得不到保持系时,才考虑使用。

4.雄性不育系的转育  通过上述方法获得了雄性不育系,如其他性状不符合要求或配合力不高时,就需要把雄性不育系的不育性转移到配合力高的系统上去,并要保持原有的优良性状,成为一个新的雄性不育系,这一工作通常采用连续回交和反复选择的方法。具体步骤因作物雄性不育性的遗传类型不同而有部分区别。如甘蓝油菜的质核互作雄性不育系Po1ima的不育细胞质已被成功地转育白菜中,育成了结球和不结球白菜的质核互作雄性不育系。

()配合力测定

杂种优势主要由等位基因间的显性效应和非等位基因间的互作效应造成,杂交组合优势的强弱,主要取决于特殊配合力。在亲本材料的自交纯化、自交不亲和系和雄性不育系选育取得一定进展的基础上,可以通过一般配合力和特殊配合力的测定,确定符合育种目标要求的优良组合,以自交不亲和系或雄性不育系作母本配制杂交种时,配合力的测定采用半轮配法;以自交系配组时,可采用轮配法。

()配组方式的确定

1.单交种  是指用两个自交系交配成的杂种一代,主要优点为基因型杂合程度最高,株间一致性强,制种程序简单,是目前常用的一种配组方式。

2.双交种  是由四个自交系先配成两个单交种,再用两个单交种配成用于生产的杂种一代品种。优点是降低杂种种子生产成本,但杂种优势和群体的整齐性不如单交种。

3.三交种  先用两个自交系配成单交种,再用另一个自交系和单交种杂交得到的杂种品种,优点是降低杂种种子生产成本,缺点为杂种优势和群体的整齐度不如单交种。

4.综合品种  将多个配合力高的异花授粉或自由授粉植物亲本在隔离区内任其自由传粉所得到的品种,适应性更强,但整齐度较差。

三、育种计划制定的内容

育种工作者在开始工作之前,应该有一个较为完整的育种计划方案,以免事倍功半。育种计划的制定因育种目标、选育方法、环境条件人力和物力条件而异,无固定模式可循。 下面以蔬菜作物甘蓝为例,说明甘蓝杂种一代新品种选育计划设计方案的制定以供参考。 ()确定育种目标及达到的技术经济指标 目前,从甘蓝生产及市场发展趋势分析,今后甘蓝的总需求量不会大量增加,但期望周年均有甘蓝供应,并且要求高品质、小型化。因此,优质抗病丰产是目前及今后一个时期内甘蓝育种的主要目标。

国家七五八五攻关项目甘蓝新品种选育技术研究专题,具体的育种目标为:

1.品质 叶球外观符合当地消费者的要求,叶球帮叶比不高于30%;叶球紧实度0.5以上,球内中心柱长不超过球高的1/2:叶质脆嫩,风味品质优良,无异味;维生素C100g含量在45mg以上,粗纤维少。

2.抗病性 抗病毒病(TuMV)兼抗黑腐病。

3.产量 高于同类主栽品种10%。

()技术路线及实施方案

1.通过多种途径广泛收集甘蓝种质资源,为项目的实施打下基础 对收集到的资源材料进行整理与观察。在当地甘蓝种植季节,在田间设观察圃地进行栽培,按当地的种植习惯,在同样的栽培管理条件下,对其植物学性状和生物学特性作观察鉴定。观察记录项目有:

(1)植物学性状:株高、开展度、外叶叶形、叶片大小、外叶数、叶色,叶面特征、叶球形状等。 (2)生物学特性:整齐度、抗病性(主要是病毒病、黑腐病等);产量(包括全株重、叶球重)、净菜率、紧实度、生育期等。 通过观察鉴定从中初步选出基本符合育种目标,并有利用价值的原始材料,进一步自交纯化,选出优良的自交不亲和系。

2.自交不亲和系的选育  甘蓝是典型的异花授粉植物,杂种优势十分明显,加之群体内自交不亲和基因频率较高,通过选择可以得到稳定的自交不亲和系供配制杂种一代之用,因此杂种优势已成为目前甘蓝育种最为主要的育种途径。

甘蓝杂优利用的正常工作程序是先从配合力强的品种中选育经济性状好的自交不亲和系,再用选出的自交不亲和系配成不同的组合,测定其产量及其他经济性状,最后选出最佳组合。但为了缩短育种年限,一般都采取经济性状选择纯化,自交不亲和系选育和配合力测验等工作同时进行的育种程序。在以上程序中,自交不亲和系的选育决定了能否获得理想的亲本,是甘蓝杂种一代选育的关键。

自交不亲和系的选育以选择具有良好经济性状,符合育种目标的地方品种、常规品种或F1,品种作为选育自交不亲和系的亲本材料。在S0代进行单株自交,每品种可入选2030株进行自交不亲和性测定。在严格的隔离条件下,花期自花授粉测定亲和指数,同时在相同植株的不同花枝上进行蕾期自交授粉,以保存种子和测定蕾期亲和指数。对初选出的优良自交不亲和植株,还应连续进行花期和蕾期自交分离、纯化,并严格测定自交不亲和性。每代都注意选择那些自交不亲和性与经济性状综合表现好,抗病性强的植株留种(每系统10株左右),直到自交不亲和性稳定为止。优良的自交不亲和系除要求系统内所有植株花期自交都不亲和外,还要求同一系统内所有植株在正常花期内相互授粉也表现不亲和。一般在S3S4代可采用混合花粉授粉法(取四五株花粉混合)或成对法进行花期系内兄妹交测定亲和指数,如测定结果为不亲和,即为自交不亲和系,花期亲和指数(指花期授粉每朵花平均结籽数)以小于0.51作为实用标准,蕾期授粉亲和指数一般要求5以上。育成1个优良的自交不亲和系一般四五代。

3.在自交不亲和系选育和经济性状鉴定的同时,对甘蓝材料抗病性进行鉴定

利用危害当地甘蓝的芜菁花叶病毒(TuMV)的代表性毒源及黑腐病菌,进行苗期室内人工接种鉴定,并与田间自然鉴定相结合,筛选出单抗和复合抗性表现较好的抗原材料。

4.同时对品质进行鉴定  利用感官鉴定法进行甘蓝外观、风味和质地的鉴定;利用理化方法分析帮叶比、叶球紧实度、中心柱长,以及纤维素、维生素C、可溶性固形物的含量等,以筛选出符合要求的优质材料。

5.配合力测定  用筛选出的符合育种目标的自交不亲和系,按照Griffing (1956)完全双列杂交的第四种方案或格子方法制定杂交计划,进行配合力测定,选配优质、多抗(TuMV兼抗黑腐病)、丰产的甘蓝杂种一代组合。

6.品种比较试验和区域性试验  将通过上述育种程序和鉴定方法选育出的优良组合,进行品比试验和区域性试验,以确定其在生产上的应用价值和品种的区域适应性,这两项工作可同时进行,选育出符合育种目标的甘蓝杂种一代品种。

7.亲本的扩大繁殖及一代杂种生产  从品比试验的后期开始,就要对表现突出组合的亲本适当扩大繁殖。一方面增加亲本种子数量,另一方面扩大F1种子量。在进行生产试验的同时,研究该组合的杂交制种技术,建立杂交种生产基地,以便新品种迅速推广。

 

()甘蓝杂种一代选育程序

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四、实验作业

选择1种有性繁殖的园艺作物,根据市场和生产需求,结合该物种的繁殖特性及现有种质资源和品种现状,制定1个杂种一代育种计划。

 

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